細胞實驗是上海達為科生物的基礎服務項目之一，由細胞平臺經驗豐富的實驗人員操作完成。
一.細胞增殖實驗
1. MTT法:是一種檢測細胞存活和生長的方法。該方法已廣泛于生物活性因子的活性檢測、抗腫瘤藥物篩選、細胞毒性試驗以及腫瘤放射敏感性測定等。它的特點是靈敏度高、經濟、快捷。原理:活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚( Formazan )并沉積在細胞中,而死細胞無此功能。二甲基亞砜( DMSO )能溶解細胞中的甲瓚,用酶聯免疫檢測儀在490nm波長處測定其吸光度值,可間接反 映活細胞數量。在一定細胞數范圍內, MTT結晶形成的量與細胞數成正比。
2. CCK-8法:可用于簡便而準確的細胞增殖和毒性分析,常用于藥物篩選、細胞增殖測定、細胞毒性測定、腫瘤藥敏試驗。原理:該試劑中含有WST-8 [化學名: 2-(2-甲氧基4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽], 它在電子載體1-甲氧基 -5-甲基吩嗪諭硫酸_二甲酯( 1-Methoxy PMS )的作用下被細胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產物( Formazan dye )。生成的甲瓚物的數量與活細胞的數量成正比。因此可利用這一特性直接進行細胞增殖和毒性分析。
3. Brdu:即5- Bromo-2'-Deoxyuridine,中文全名5溴脫氧尿嘧啶核苷,為胸腺嘧啶的衍生物,可代替胸腺嘧啶在DNA合成期, S期活體注射或細胞培養(yǎng)加入。而后利用抗Brdu單克隆抗體ICC染色顯示增殖細胞。同時結合其它細胞標記物雙重染色可判斷增殖細胞的種類,增殖速度,對研究細胞動力學有重要意義。但由于抗體分子量大,難于摻入并被有效檢測。因此BrdU檢測需采用DNA酶或HCI或加熱使DNA變性。這些處理方法會破壞抗原識別位點,此外許多細胞周期分析的染料都需要dsDNAD這種處理方法也使得同一樣本無法同時進行細胞周期分析。
4. EDU:即5-Ethynyl-2' - deoxyuridine,是-種胸腺嘧啶核苷類似物,能夠在細胞增殖時期
代替胸腺嘧啶(T )滲入正在復制的DNA分子中。通過基于EdU與Apollo熒光染料的特異性反應快速檢測細胞DNA復制活性,適用于細胞增殖、細胞分化、生長與發(fā)育、DNA修復、病毒復制、細胞標記示蹤等方面的研究,尤其適合進行siRNA、miRNA、 小分子化合物及其他藥物的篩選實驗。
二、細胞凋亡
ANNEXIN V-PI法:在正常細胞中,磷脂酰絲氨酸( PS )只分布在細胞膜脂質雙層的內側,而在細胞凋亡早期,細胞膜中的磷脂酰絲氨酸( PS )由脂膜內側翻向外側。Annexin V是一種分子量為35~ 36kD的Ca2+依賴性磷脂結合蛋白,與磷脂酰絲氨酸有高度親和力,故可通過細胞外側暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細胞的胞膜結合。因此Annexin V被作為檢測細胞早期凋亡的靈敏指標之- -。將Annexin V進行熒光素( EGFP、FITC )標記,以標記了的Annexin V作為熒光探針,利用熒光顯微鏡或流式細胞儀可檢測細胞凋亡的發(fā)生。碘化丙啶( Propidium Iodide, PI) 是一種核酸染料,它不能透過完整的細胞膜,但對凋亡中晚期的細胞和死細胞, PI能夠透過細胞膜而使細胞核染紅。因此將Annexin V與PI匹配使用,就可以將處于不同凋亡時期的細胞區(qū)分開來。
三、細胞遷移和侵襲
1. Transwell :是一種侵襲實驗技術,其實原理簡單地說就是用一層膜將高營養(yǎng)的培養(yǎng)液和低營養(yǎng)的培養(yǎng)液隔開,細胞放在低營養(yǎng)的培養(yǎng)液里,為了找吃的,細胞會往高營養(yǎng)的培養(yǎng)液里面跑,但是有膜擋著,所以要穿過膜才行。我們在膜上涂上- -層基質膠,模仿細胞外基質,于是細胞要把基質消化了才可以從低營養(yǎng)的培養(yǎng)液跑到高營養(yǎng)的培養(yǎng)液里面,后我們檢測高營養(yǎng)的培養(yǎng)液里細胞量就可以知道細胞的侵襲能力了。
2.劃痕實驗:是簡捷測定細胞遷移運動與修復能力的方法,類似體外傷口愈合模型,在體外培養(yǎng)皿或平板培養(yǎng)的單層貼壁細胞上,用微量槍頭或其它硬物在細胞生長的中央區(qū)域劃線,去除中央部分的細胞,然后繼續(xù)培養(yǎng)細胞至實驗設定的時間(例如72h),取出細胞培養(yǎng)板,觀察周邊細胞是否生長(修復)至中央劃痕區(qū),以此判斷細胞是否生長(修復)至中央劃痕區(qū),以此判斷細胞的生長遷移能力, 實驗通常需設定正常對照組和實驗組,實驗組是加了某種處理因素或藥物、外源性基因等的組別,通過不同分組之間的細胞對于劃痕區(qū)的修復能力，可以判斷各組細胞的遷移與修復能力。
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